Монастырь стоит в излучине реки Вологды, в стороне от центра: село Прилуки, вокруг которого он рос, вошло в черту города только в 1993 году. Обитель основана в 1370-е годы Димитрием Прилуцким — игуменом Никольского монастыря в Переславле-Залесском и духовным другом Сергия Радонежского. По житию, Димитрий ушёл из Переславля, тяготясь славословием и восхвалением, и направился на север, к Холодному морю. Сначала он поставил церковь Воскресения на реке Леже, но окрестные жители попросили старца уйти: боялись, что он овладеет ими и их сёлами. Тогда Димитрий пришёл в Вологду и выбрал место в излучине. Землю под обитель дали Илья и его сосед Исидор по прозвищу Выпряг — 2 горожанина, позволившие вытоптать ради этого засеянное поле. Крест, который святой поставил на выбранном месте, хранится в монастыре до сих пор.
Строительству помогал Дмитрий Донской: он жертвовал средства, а Димитрий был крёстным отцом его детей. Здесь впервые на Русском Севере ввели общежительный устав, взяв за образец Троице-Сергиев монастырь; при жизни основателя обитель называли лаврой. Димитрий умер около 1406 года и был погребён в деревянном Спасском соборе.
Каменным монастырь стал в шестнадцатом веке: Спасский собор возвели в 1537—1542 годах, стены и башни — в 1640-е — 1650-е, закончив их в 1656-м. Иван Грозный побывал здесь в 1545 году, а в 1552-м брал в поход на Казань монастырский Киликийский крест. В 1812 году сюда, в обгоревший после пожара собор, свезли драгоценности патриаршей ризницы и московских монастырей — переждать нашествие.
Собор — пятиглавый, на подклете, с тремя апсидами; фасады делят широкие лопатки, а к барабанам ведут ярусы закомар, и объём нарастает к центру. С трёх сторон его окружает двухъярусная галерея с открытыми арками, к западному порталу ведёт крыльцо на кувшинообразных столбах. Ограда длиной 950 метров, в ней 5 башен и стены толщиной больше 2 метров.
Монастырь был и местом ссылки. В 1493 году Иван Третий заточил сюда сыновей опального углицкого князя — Ивана и Дмитрия; старший провёл в оковах почти 30 лет и умер, приняв перед смертью постриг под именем Игнатий. В двадцатом веке всё перевернулось: в середине 1920-х обитель закрыли, в 1930-е здесь была пересыльная тюрьма для раскулаченных, потом военные склады, кинотеатр и дом инвалидов.
В 1992 году монастырь полностью вернули церкви. Внутри стоит Успенская церковь, перенесённая из Александро-Куштского монастыря; её считают древнейшей сохранившейся деревянной шатровой церковью России — первая четверть шестнадцатого века. Житийную икону Димитрия работы Дионисия, написанную около 1503 года, забрал музей, в соборе остался список. Братия сегодня — около 15 человек.